我們的釀酒酵母基因表達(dá)載體系統(tǒng)是基于廣泛使用的pYES2載體而構(gòu)建的，它是一個(gè)可用于在酵母中表達(dá)重組蛋白，或者通過(guò)在酵母中進(jìn)行過(guò)表達(dá)以研究基因功能的強(qiáng)大而有效的系統(tǒng)。目的基因可以克隆在該載體上，通過(guò)客戶選擇的啟動(dòng)子來(lái)介導(dǎo)表達(dá)。VectorBuilder上有幾種可供選擇的標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子，其中之一是來(lái)自酵母半乳糖激酶（GAL1）基因的強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，它是酵母重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中最常用的啟動(dòng)子。

在典型的酵母實(shí)驗(yàn)菌株（如INVSc1）中，GAL1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性與培養(yǎng)基中的碳源有一定的關(guān)系。在葡萄糖存在的情況下，GAL1啟動(dòng)子的的轉(zhuǎn)錄受到抑制；半乳糖則會(huì)激活該啟動(dòng)子。因此，通過(guò)簡(jiǎn)單地去除葡萄糖的培養(yǎng)基，并用含有半乳糖的培養(yǎng)基替代，可以實(shí)現(xiàn)目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)。

或者，將棉子糖作為碳源。棉子糖既不抑制也不誘導(dǎo)GAL1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，即使在棉子糖存在情況下，加入半乳糖也足以激活GAL1啟動(dòng)子。與使用葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞相比，半乳糖對(duì)使用含棉子糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞誘導(dǎo)更快。然而，由于棉子糖無(wú)法抑制GAL1啟動(dòng)子，所以該方法會(huì)導(dǎo)致誘導(dǎo)前目的基因的“泄漏”表達(dá)。

通常情況下，利用葡萄糖維持培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)后約4小時(shí)可檢測(cè)到重組蛋白的表達(dá)，而用棉子糖培養(yǎng)的細(xì)胞僅需約2小時(shí)即可。我們建議您設(shè)置一個(gè)時(shí)間梯度來(lái)優(yōu)化重組蛋白的表達(dá)。

該載體系統(tǒng)的更多信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。

該載體系統(tǒng)用于在釀酒酵母中組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)目的基因。將GAL1啟動(dòng)子和目的基因克隆到載體上，然后通過(guò)向培養(yǎng)基中加入半乳糖來(lái)誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。培養(yǎng)基中的葡萄糖會(huì)抑制目的基因的表達(dá)，可使用棉子糖作為替代碳源，它不會(huì)激活和抑制GAL1啟動(dòng)子。

圖1 使用我們的游離體DNA載體在酵母中表達(dá)EGFP。（A）攜帶EGFP基因的游離體DNA載體被轉(zhuǎn)化至尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型釀酒酵母。EGFP表達(dá)使用GPD啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。EGFP序列經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化。（B）使用熒光顯微鏡觀察EGFP在轉(zhuǎn)化后的酵母中的表達(dá)。

高水平表達(dá)：誘導(dǎo)型GAL1啟動(dòng)子可以使目的基因高水平表達(dá)。

表達(dá)嚴(yán)謹(jǐn)：在GAL1啟動(dòng)子的控制下，葡萄糖會(huì)高效抑制目的基因的表達(dá)，而半乳糖則會(huì)高效激活其表達(dá)。

快速誘導(dǎo)：棉子糖培養(yǎng)的細(xì)胞誘導(dǎo)后約2小時(shí)內(nèi)可檢測(cè)到GAL1介導(dǎo)的重組蛋白。

潛在泄漏表達(dá)：對(duì)于由GAL1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的蛋白表達(dá)，棉子糖可以替代葡萄糖或者半乳糖用作碳源。然而，棉子糖無(wú)法抑制GAL1啟動(dòng)子的活性，這會(huì)引起目的基因的泄漏表達(dá)。葡萄糖可以用于抑制GAL1啟動(dòng)子的活性。

Promoter: The promoter that drives your gene of interest is placed here. When the inducible GAL1 promoter is used, galactose will induce high-level transcription of the gene of interest, while glucose will strongly repressed expression. 

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

CYC1 terminator: Sequence which facilitates transcriptional termination and polyadenylation of mRNA in yeast.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

Marker: A yeast selectable marker is placed here. It allows the yeast cells successfully transformed with the vector to be selected. One commonly used marker is the orotidine-5'-phosphate decarboxylase (URA3) gene, which allows selection of yeast transformants in uracil or uridine deficient medium. Additionally, if 5-Fluoroorotic acid (5-FOA) is added to the media, the URA3 gene product will convert 5-FOA into 5-fluorouracil, which is a toxin that will cause cell death, thereby allowing selection against yeast carrying the plasmid.

2µ ori: Origin of replication which permits high-copy replication and maintenance in S. cerevisiae.